ELISA标准曲线制作详细步骤与质控要点

    ELISA标准曲线制作详细步骤与质控要点

    一、标准品准备与梯度稀释

    复溶与稀释‌：冻干标准品需用试剂盒提供的稀释液复溶，按说明书稀释为梯度浓度（如0.312-20ng/mL），覆盖待测样本预期范围‌。

    加样精度‌：使用校准后的移液器，每个浓度设置2-3个复孔，避免气泡或残留，确保体积误差≤5%‌。

    二、同步检测与OD值读取

    操作规范‌：标准品与待测样本需在同一酶标板中同步检测，避免孵育时间差异‌。

    试剂状态‌：确保试剂盒在有效期内，HRP标记抗体无沉淀或失活‌。

    三、数据拟合与曲线绘制

    模型选择‌：

    线性拟合（窄浓度范围，R²≥0.99）‌。

    四参数Logistic（S型曲线，R²≥0.99）‌。

    软件工具‌：推荐GraphPadPrism或ELISACalc，自动生成曲线并计算样本浓度‌。

    四、质控参数验证

    加标回收率‌：

    公式：回收率=(测定回收样本浓度均值-基础样本浓度均值)/加入浓度×100%‌。

    合格标准：80%-120%（高、中、低浓度平均值）‌。

    稀释线性‌：样本稀释后OD值应与理论值呈线性（R²≥0.99）‌。

    精密度控制‌：

    板内差（CV<5%）、板间差（CV<8%）‌。

    空白孔OD值应<0.1，否则排查背景干扰‌。

    五、常见问题与解决

    曲线异常‌：若R²<0.98，检查标准品稀释误差或试剂失效‌。

    样本超范围‌：稀释后重新检测，结果乘以稀释倍数‌。

    注：以上仅供参考！

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